Kiedy do Sparty dotarły wieści, że Persowie po raz drugi w ciągu 10 lat zbliżają się do greckiego serca, tylko król Leonidas i jego specjalnie dobrana grupa 300 osób zostali wysłani, aby ich powstrzymać. Leonidas zabrał po drodze kilku tysięcy greckich rekrutów, zmusił około 1100 wojskowych z Beotii do przyłączenia się do niego, a następnie pomaszerował do strategicznej przełęczy zwanej Termopilami. Tutaj około 7000 żołnierzy zostało ostatecznie zdymisjonowanych, gdy Persowie ich otoczyli. Leonidas odmówił odwrotu i trzymał się na przełęczy przez prawie trzy dni, prawdopodobnie odbyło się to w sierpniu 480 r. p.n.e.
Głównym historykiem tej bitwy jest Herodot, który pomija wiele sprzecznych szczegółów znanych z zapisów innych pisarzy i współczesnych archeologów. Inne drogi pozwoliłyby Persom posuwać się naprzód, ale z jakiegoś powodu wybrali Termopile jako główny atak? Być może perscy generałowie spodziewali się, że Grecy zastraszą się, ponieważ czekali trzy dni przed atakiem na Termopile. Przez pierwsze dwa dni Leonidas i jego ludzie znakomicie bronili przełęczy. Trzeciego dnia walk miejscowi pokazali Persom alternatywny i niestrzeżony szlak przez wyżyny. Po całonocnym marszu elitarnych sił perskich zwanych Nieśmiertelnymi, Leonidas i jego żołnierze stanęli w obliczu tylnego ataku, a także frontalnego ataku perskiego oddziału regularnego. Pomimo zaciekłego oporu Spartan, który zabili dwóch perskich książąt, Leonidas i jego wszyscy 300 zostali wymordowani. Większość sojuszników również została wybita, z wyjątkiem kilku Tebańczyków, o których mówi się, że się poddali.
Upływ czasu tylko zwiększył reputację Leonidasa. Persowie okaleczyli ciało Leonidasa, ale 40 lat później Spartanie twierdzili, że odzyskali zwłoki. Podczas uroczystego ponownego pochówku w V wieku p.n.e. sanktuarium bohatera zostało założone dla Leonidasa w Sparcie. Gdzieś na polu bitwy wzniesiono pomnik, który oznajmiał przyszłym pokoleniom chwałę Leonidasa i jego 300 spartanom: „Nieznajomy, powiedz Spartanom, że tu leżymy, będąc posłuszni ich słowom”. Słynny poemat liryczny głosi: „Słynna była ich fortuna i sprawiedliwy ich los. Ich grób jest ołtarzem; zamiast lamentów mają wspomnienie, zamiast litości, chwałę. Ich całun jest taki, że ani rozkład, ani zwycięstwo czasu nie dotkną, ponieważ byli odważnymi ludźmi, a ich cmentarz przybrał chwałę Grecji dla swojego więźnia. Świadczy o tym Leonidas, król Sparty, który pozostawił po sobie wielki pomnik męstwa i wiecznej chwały”. Ostatecznie dzielna akcja Leonidasa opłaciła się. Prawdopodobnie wierzył, że może wytrzymać ze swoją małą grupą, biorąc pod uwagę jego początkowy sukces pod Termopilami. Potajemne nadejście perskich nieśmiertelnych całkowicie go zaskoczyły. Jednak zatrzymanie Persów przez dwa dni prawdopodobnie spowodowało konieczność zaangażowania się w bitwę pod Artemisium, starcie morskie, które wygrali Grecy. Leonidas dał Atenom czas na ewakuację, dzięki czemu zwyciężyła grecka flota.