Pod koniec rządów ostatniego z Jagiellonów wybuchł na nowo konflikt z Moskwą. Walki, toczone dawniej o tereny leżące w dorzeczu Dniepru (zwłaszcza o Smoleńsk), przeniosły się teraz ku dorzeczu Dźwiny, mianowicie na terytorium Inflant. Prowincja ta, pozostająca od XIII wieku w posiadaniu zakonu kawalerów mieczowych, aż do roku 1525 stanowiła inflancką część państwa krzyżackiego. Po jego sekularyzacji dni państwa zakonnego w Inflantach, które sąsiadowało z potężną Rzeczpospolitą oraz prącą ku Bałtykowi Moskwą, były praktycznie biorąc policzone. W tej sytuacji Zygmunt August zdołał uprzedzić swego wschodniego sąsiada i w roku 1557 wymusił na wielkim mistrzu kawalerów mieczowych zawarcie z Litwą sojuszu, wymierzonego przeciwko Iwanowi IV Groźnemu. Car odpowiedział wkroczeniem w roku następnym do Inflant, zajmując Dorpat i Narwę, ważny port nad Zatoką Fińską. Równocześnie Szwedzi okupowali północ kraju, a wojska duńskie wylądowały na wyspie Ozylii. Postawiony w sytuacji przymusowej, wielki mistrz zakonu Gotthard Kettler zdecydował się na sekularyzację Inflant, a następnie poddał je królowi polskiemu w zamian za gwarancję autonomii terytorialnej i swobód wyznaniowych dla luteranizmu, stanowiącego konfesję większości mieszkańców. Dotychczasowy wielki mistrz, już jako świecki książę, otrzymał od Zygmunta Augusta w lenno Kurlandię i Semigalię. Cała reszta Inflant przeszła pod wspólne (od roku 1569) władanie Polski i Litwy.
W ten sposób został zapoczątkowany zbrojny konflikt Polski, wspomaganej przez Danię, z Moskwą, po której stronie stanęła Szwecja. Wojna o Inflanty trwała aż siedem lat 11563-1570), w trakcie których doszło między innymi do odwrócenia przymierzy. Szwedzi stanęli bowiem po stronie polsko-litewskiej, a Duńczycy – Moskwy, która przyznała ich księciu, Magnusowi, Inflanty we władanie lenne wraz z ręką siostrzenicy cara. Działania wojenne przerwał kongres w Szczecinie (1570), utrzymujący faktyczny podział Inflant, oraz rozejm litewsko-moskiewski, zawarty na trzy lata.
Ofiary krwi i pieniądza nie były jedynymi, jakie zapłaciła Polska za udział w tej wojnie. Zygmunt August, licząc na pomoc Albrechta w walce z Moskwą, wyraził zgodę (1563), by sukcesję po nim przejęła frankońska, a następnie elektorska linia Hohenzollernów. Warto dodać, że w trzy lata później Zygmunt nie usłuchał apelu stanów pruskich, które prosiły go, aby odebrał władzę starzejącemu się księciu i powierzył ją powołanemu przez Kraków gubernatorowi. Król poprzestał wówczas na mianowaniu nadzwyczajnej komisji, która dokonała rewizji obowiązującego w Prusach ustawodawstwa pod kątem ograniczenia książęcego absolutyzmu na rzecz wolności stanowych.
Prowadzenie wojny, w tym również i morskiej, o Inflanty skłoniło króla do stworzenia floty kaperskiej (tak nazywano w ówczesnej Europie żeglarzy walczących na własną rękę, ale z upoważnienia króla lub miasta). Flota ta utrzymywała się z łupów wojennych, uzyskanych między innymi w trakcie blokady wybrzeży Szwecji, dochodząc pod koniec lat sześćdziesiątych do liczby około sześćdziesięciu okrętów. Działalność kaprów wywoływała protesty Gdańska, który jedenastu z nich powiesił w roku 1567 za złupienie chłopów na Kaszubach. Strzelano też do okrętów królewskich, szukających w tym porcie schronienia przed burzą. W odpowiedzi Zygmunt August powołał w roku 1568 stałą Komisję Morską, która w dwa lata później pragnęła narzucić miastu twarde dla jego autonomii „statuty Karnkowskiego”. Nic weszły one jednak w życie, a Duńczykom udało się zniszczyć znaczną część floty kaperskiej. Rychła śmierć króla (1572) położyła kres dalszej rozbudowie polskiej marynarki wojennej, z której (jak również i samego morza) znaczenia społeczeństwo szlacheckie nie zdawało sobie sprawy.
Zygmunt August mimo trzykrotnych związków małżeńskich (w tym z Elżbietą i Katarzyną Habsbuiżankami) nie pozostawił po sobie następcy. lego ożenek z Barbarą Radziwiłłówną (1547) spotkał się z ostrym sprzeciwem większości magnatem oraz szlachty. Dopiero na rok przed śmiercią Barbary (1551) król zdołał doprowadzić do jej koronacji.