Pierwszy Waza na polskim tronie dość rychło stracił sympatię szlachty. Zygmuntowi zarzucano fałszywy i skryty charakter, forytowanie cudzoziemców, wreszcie zamiłowanie do rozrywek niegodnych monarchy. Największym kamieniem obrazy były jednak jego starania o wzmocnienie władzy królewskiej. Wazę podejrzewano o chęć zaprowadzenia w Polsce absolutyzmu opartego na koterii dworskiej, złożonej z magnatów zarówno świeckich, jak i duchownych, oddanych królowi. Program tej partii, sformułowany między innymi w książkach Krzysztofa Warszewskiego oraz w „Kazaniach sejmowych” Skargi, mógł istotnie wzbudzić żywy niepokój szlachty, ponieważ chciano ją pozbawić większości uzyskanych w XV i XVI wieku przywilejów (z neminem captivabimus na czele), izbie poselskiej zaś pozostawić wyłącznie głos doradczy. Z pewnych aluzji Skargi łatwo się domyślić, że pragnąłby on znieść w ogóle instytucję wolnej elekcji (nazywanej powszechnie źrenicą „złotej wolności”), wprowadzając na jej miejsce dziedziczność tronu.
Wszystko to sprawiło, iż opozycja postanowiła za pomocą zbrojnej demonstracji wymusić na monarsze zmianę kierunku polityki wewnętrznej. Korzystając z zagwarantowanego w artykułach henrykowskich prawa do oporu, podniesiono bunt, nazwany rokoszem Zebrzydowskiego (od nazwiska przywódcy, wojewody krakowskiego Mikołaja Zebrzydowskiego) bądź sandomierskim |od miasta, pod którym odbył się główny zjazd rokoszan). Trwał przez blisko trzy lata (1606-1609); jego konsekwencje okazały się decydujące dla dalszego rozwoju sytuacji wewnętrznej Rzeczypospolitej. Po obu stronach zużyto mnóstwo atramentu i farby drukarskiej; wicie też mów wygłoszono na zjazdach w Lublinie, Jędrzejowie, Sandomierzu czy Wiślicy. Regaliści bronili zagranicznej i wewnętrznej polityki dworu królewskiego, rokoszanie pragnęli narzucić monarsze daleko idące ograniczenia jego władzy; chciano między innymi odebrać mu prawo rozdawania wakansów, wprowadzić obieralność urzędników ziemskich, zmusić posłów do ścisłego przestrzegania instrukcji sejmikowych (pod groźbą odpowiedzialności przed pospolitym ruszeniem).
Wśród rokoszan oprócz katolików znalazło się też wiciu różnowierców i prawosławnych, oburzonych polityką wyznaniową Zygmunta III, który nie zgadzał się na uchwalenie ustawy wykonawczej, zapewniającej przestrzeganie postanowień konfederacji warszawskiej. Wiązało się to z jego nietolerancyjną postawą, na co było aż nadto dowodów; rozdawnictwo dóbr i urzędów przede wszystkim pomiędzy katolickich stronników monarchy (datujące się od roku 1591) pociągało za sobą nie tylko zmniejszanie się liczby protestanckich senatorów, ale i rosnące niezadowolenie wśród kalwinów, luteranów czy braci polskich. Rozgoryczeni tym dysydenci zaczynali myśleć o zbrojnym oporze wobec króla, który przyglądał się obojętnie napadom na ich miejskich współwyznawców.
Do sojuszu z protestantami w obronie wspólnych praw wyznaniowych skłaniali się również i prawosławni. Zwolennicy Kościoła wschodniego, cieszący się dotąd dużymi swobodami wyznaniowymi, musieli pod koniec XVI wieku podporządkować się unii z Kościołem rzymskokatolickim. Na synodach w Brześciu Litewskim, odbytych w latach 1595 i 1596, biskupi prawosławni uznali zwierzchnictwo papieża za cenę nienaruszania ich przywilejów. Odrębny miał pozostać obrządek, zachowywano również własny język liturgiczny i małżeństwo księży. Rychło jednak okazało się, że zwolennicy unii są w mniejszości. Przeciwko ugodzie brzeskiej wypowiedziała się bowiem znaczna część społeczeństwa ruskiego, a więc niższy kler prawosławny, chłopi, mieszczanie oraz spory odłam szlachty z wpływowym magnatem ukraińskim, księciem Konstantym Ostrogskim, na czele. Całe dwie diecezje, lwowska i przemyska, pozostały nadal przy dyzunii. Niewątpliwy sukces kontrreformacji, która – kierując się otrzymanymi z Rzymu dyrektywami – pragnęła w ten sposób umocnić jedność wyznaniową państwa, przyniósł w następstwach dalszą groźną komplikację stosunków wewnętrznych Rzeczypospolitej. W walce z unią prawosławni w XVII wieku zaczęli się bowiem oglądać na pomoc zagranicy, a hasło obrony tej wiary przed „Lachami” posłużyło za sztandar ideologiczny buntującej się Kozaczyźnie.
Nakładanie się konfliktów wyznaniowych na polityczne utrudniało osiągnięcie porozumienia pomiędzy królem a rokoszanami. Po przewlekłych i bezpłodnych pertraktacjach obie strony chwyciły za oręż. W lipcu 1607 roku wojskom królewskim udało się pod Guzowem (koło Radomia) pokonać główne siły przeciwników. W rok później upokorzony Zebrzydowski musiał przeprosić króla na posiedzeniu senatu w Krakowie. Trudno to jednak uznać za triumf Zygmunta III Wazy, skoro rokosz uczynił na długo nieaktualne wszelkie próby wzmocnienia władzy monarszej w Polsce. lego rezultatem było między innymi ostateczne sprecyzowanie prawa do wypowiedzenia królowi posłuszeństwa (artykuł de non praestanda oboedientia). Kancelaria królewska mała odtąd spisywać uchwały senatu, a senatorowie-rezydenci zdawać sprawę przed sejmem z ich realizacji.
Zwycięsko z rokoszu wyszła w gruncie rzeczy magnateria, zarówno ta skupiona wokół króla, jak i frondująca przy boku Zebrzydowskiego. Wymogła ona zakończenie walk kompromisem, na mocy którego przywódcom opozycji włos z głowy nie spadł. Pod osłoną frazesu o „złotej wolności” zaczęła sobie torować drogę do władzy oligarchia magnacka, choć okres jej fanatycznych rządów miał się rozpocząć dopiero w drugiej połowie XVII wieku. Oprócz monarchy koszta wystąpień z lat 1606-1609 poniosła średnia szlachta, tłumnie uczestnicząca w rokoszu. Z jej planów bowiem, aby przekształcić ten ruch w kolejny etap walk o egzekucję praw, nic się nie ostało. Pogorszyła się również gospodarcza sytuacja tej warstwy, ponieważ folwarki średnioszlacheckie dość często nie wytrzymywały konkurencji z latyfundiami. W jeszcze fatalniejszej sytuacji znajdowała się drobna szlachta.